جداسازی و کلونینگ ژن لیپاز باکتری باسیلوس سابتیلیسdr8806 در e. coli bl21

در این مطالعه، ژن کد کننده آنزیم لیپاز باکتری bacillus subtilis dr8806 با استفاده از آغازگرهای اختصاصی لینکردار دارای جایگاه برش برای آنزیم های محدوالاثر bamh? و hind??? جداسازی و در وکتور همسانه سازی ptz57r/t کلون گردید. پس از تاًیید صحت کلونینگ توسط کلونی pcrو برش آنزیمی، پلاسمیدهای نوترکیب حامل ژن هدف به منظور تعیین توالی مورد استفاده قرار گرفتند. توالی ژن لیپاز دارای موتیف حفاظت شده ser-met-gly-ala-his و یک قالب خوانش کامل با طول 639 جفت باز است که یک پیش ساز 212 آمینواسیدی را کد می کند. پس از جاگذاری قطعه الحاقی در وکتور بیانی، وکتور نوترکیب با روش شوک حرارتی به سلول های مستعد escherichia coli bl21(de3)انتقال یافت. تاًیید اولیه حضور ژن هدف در وکتور بیانی به کمک روش کلونی cracking صورت گرفت. همسانه سازی ژن لیپاز در وکتور (+) pet-28a با روش های کلونیpcr ، هضم دوگانه آنزیمی و miniprep pcrتاًیید شد.بیان ژن لیپاز در سلول های میزبان باالقای پروموترt7باکتریوفاژی در حضور القاگر iptg ( mm1، c° 25، 6 ساعت انکوباسیون) انجام گرفت. آنزیم نوترکیبدارای برچسب هیستیدین در انتهای آمین، به کمک کروماتوگرافی تمایلی ni-nta تخلیص شد. آنزیم لیپاز با وزن مولکولی 26.8 کیلودالتون و فعالیت ویژهu/mg 1364، دارای حداکثر فعالیت در c°70 و 8 ph است. یون های دوظرفیتی hg2+و cu2+اثر مهاری شدیدی بر فعالیت آنزیم دارند. بیش از 90% از فعالیت آنزیم در حضور dtnb،sds ، triton x-100 و dttحفظ گردید. لیپاز نوترکیب پایداری قابل توجه ای در حلال‏های آلی نظیر کلروفرم، هپتان و متانول نشان داد. فعالیت آنزیم در حضور مایعات یونی بر پایه ایمیدازولیوم افزایش یافت. پایداری بالای آنزیم در طیف گسترده ای از دما و ph ، مایعات یونی، دترجنت ها و شوینده‏های تجاری از جمله ویژگی های مطلوب این آنزیم به منظور استفاده در صنایع مختلف به ویژه فرمولاسیون مواد شوینده است.